通用型PCR试剂盒(富含GC模板)

产品货号：

GS0157

中文名称：

通用型PCR试剂盒(富含GC模板)

英文名称：

GC-rich PCR Kit

产品规格：

50次|100次

发货周期：

1～3天

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PCR反应中有时由于引物或模板中GC含量过高导致双链变性及引物与模板退火困难。并普通Taq DNA Polymerase在98℃的时候很容易就失活，从而导致PCR失败，百奥莱博针对高GC含量和复杂二级结构的模板设计的PCR buffer及Hot TaqDNA Polymerase可增强反应的特异性及稳定性，从而获得好的实验结果。以人类血液基因组DNA为模板，能够扩增出GC含量为78%的DNA片段。

组分	50次	100次
Taq DNA Polymerase (5U/μL)	25μL	50μL
2×High GC PCR Buffer(with Mg²⁺)	1.25mL	2.5mL
dNTP Mix(10mM)	25μL	50μL
Sterilized ddH2O	3mL	5mL

保存：-20℃

模板DNA准备：基因组DNA，反应体系中模板浓度推荐范围1～10μg/mL；质粒或噬菌体DNA浓度0.1～1ng/mL。
引物准备：引物浓度推荐范围0.05～1μM。
在无菌洁净的PCR管中，参考下面体系配制反应溶液，以50μL体系为例。
成分用量
Sterilized ddH2O 补足50μL
模板DNA 10～100ng
2×High GC PCR Buffer（with Mg²⁺） 25μL
Primer 1 (10μM) 2μL
Primer 2 (10μM) 2μL
dNTP Mix 0.5μL
Taq DNA Polymerase 0.5μL
轻轻混匀后短暂离心。
加适量的矿物油后，置于PCR仪中进行PCR反应。
- 对于有热盖的PCR仪可不加矿物油。

影响PCR扩增的因素

模板	DNA 50μL体系中，通常质粒或噬菌体DNA模板加入量为0.01～1ng，基因组DNA模板加入量为0.05～0.5μg。过高的模板量会增加非特异性PCR产物含量。如果对合成的保真度要求高，模板DNA增加量要与所需扩增产物的增加成比例。许多方法都可用来纯化模板DNA，但在纯化DNA模板中，即使微量的试剂（如苯酚、EDTA、蛋白酶k等）都会强烈抑制Taq酶活性。使用乙醇沉淀并且反复使用70%的乙醇洗涤处理，可有效地去除模板DNA中所含的微量污染物。
引物	通常PCR引物的长度为18～25个碱基。GC含量应在40～60%之间，C和G在整个引物中应均匀分布。应避免在引物的3'末端超过3个C或G，否则会增加非特异性引物。在反应混合物中应该防止引物的自连以及与其他的引物相连，这样可以避免引物二聚体和发夹环结构的形成。
MgCl₂ 浓度	Mg²⁺是混在dNTPs，引物和DNA模板中的。实验中，应选择最佳的Mg²⁺浓度。Mg²⁺浓度不足会降低PCR产物产量，而反之则可能增加非特异性产物量，降低合成的准确性。在标准反应中，MgCl₂推荐浓度在1～4mM。根据经验，dNTP的终浓度为0.2mM时，则MgCl₂的最适浓度应该在1.25～1.75mM。若模板DNA中包含有EDTA或其他螯合剂时，应适当增加MgCl₂浓度。
dNTP	通常每个反应混合物中单个dNTP的浓度应该在200μM。dNTP终浓度在10～50μM时，DNA可以准确合成，在此浓度范围内，PCR产物可获得高保真性。而MgCl₂的浓度应从1mM起，以0.1mM的梯度递增，直到获得最适浓度。
Taq酶	通常在100μL反应混合物中加入2～3U的Taq酶，过高的Taq酶浓度会导致合成非特异性产物。若反应混合物中存在含有抑制剂（如使用了未经完全纯化的模板DNA），为了获得高产的扩增产物，可增加Taq酶的含量（4～5U）。
预变性	PCR反应初始阶段，DNA模板完全变性非常关键。不完全变性可能导致第一次扩增循环中模板的使用效率低，PCR产物产量少。如果GC含量等于50%或更低时，推荐95℃预变性1～3分钟。若富含GC的模板，间隔时间应延长至10分钟。若95℃下预变性时间小于3分钟，则可将Taq酶加入到初始反应混合物中。若必须增加预变性时间或是提高预变性温度，应在预变性之后加入Taq酶（Taq酶在超过95℃的条件下会大大降低稳定性）。
变性	一般来说，在第一次扩增循环中所合成的PCR产物要明显短于模板DNA，且在该条件下可被完全变性，所以94～95℃变性1～2分钟足矣。若扩增DNA的GC含量很高，则应延长变性时间至3～4分钟。也可利用附加物使DNA变性，如甘油（最高可达10~15的体积百分比），DMSO (最高达10%)或甲酰胺(最高至5%)。但附加物存在会明显降低引物-模板DNA复合物的溶解温度，所以应该根据经验来选择合适的退火温度。使用附加物，需要适当的增加Taq酶的浓度（DMSO或甲酰胺会抑制大约50%的Taq酶）。通常在反应混合物中用7-deaza-dGTP来代替dGTP，这样可以降低PCR反应的溶解温度。
引物退火	通常最佳退火温度应该是比引物-模板DNA溶解温度低5℃。若所获得的非特异性产物要高于目的产物，则需要每次增加1～2℃退火温度来优化产物的特异性直至达到最佳退火温度。
延伸步骤	通常在70～75℃进行延伸，当扩增大片段时，每1kb需增加1分钟的延伸时间。
循环次数	如果模板DNA的拷贝数小于10，则40个循环就可以。如果初始模板DNA的量更高，那么25～30个循环足矣。
最终延伸	在最后一个循环结束后，样品需要在72℃下温浴5～15分钟来补平新合成的PCR产物的延伸末端。同时，Taq酶的末端转移酶的活性可以在PCR产物的3'末端增加一个A。如果PCR片段将被用于克隆到T/A载体上，最终延伸时间可延长至30分钟。

成分	用量
Sterilized ddH2O	补足50μL
模板DNA	10～100ng
2×High GC PCR Buffer（with Mg²⁺）	25μL
Primer 1 (10μM)	2μL
Primer 2 (10μM)	2μL
dNTP Mix	0.5μL
Taq DNA Polymerase	0.5μL

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